寄一次实验 - 装模作样把它写成实验记录的样子…

这是装模作样的实验记录的第二次记录, 这次的实验怎么说呢, 有点手忙脚乱了. 因为慌了.

虽然, 我觉得这次的实验的原理真的很简单的样子. 呵, 也只是”样子”而已.

可以概括为, 先用限制性内切酶把之前提取的质粒DNA的DNA切开, 然后再通过电泳的方式来把被切开的和其他的东西分开, 然后再通过分离的方式来提取出DNA.

酶名字

名字也挺重要, SalI, 这个就是我所用的限制性内切酶的名字. (一开始叫错了被笑了, 谁叫这玩意长得很迷惑呢? ) 这个读作S - A - L - One.

酶切

构建酶切体系

酶促反应应当要满足合适的环境, 所以就要设置这样的环境满足我要的梅切环境:

  • 被切的 质粒DNA 1μg
    ( 这里有一个坑, 就是质粒DNA的质量要用浓度来计算, 我实验的时候第一次忘了, 只好重新做第二次. 但是这个时候上一次的质粒DNA的提取结果就让我很尴尬了. 因为之前的浓度很低80.45%左右, 然后着就导致了我这一次测的浓度就很感人了. )
  • 缓冲液 10X 酶切 Buffer 3μL 提供一个良好的酶反应环境
  • 限制性内切酶 用来切的 刀子
    (之所以叫 限制性 内切酶, 是因为这样的内切酶会和DNA中相应的特殊部分结合, 然后再这里被切断. 有点像仔细画线后的锯割和无规则乱砍的区别? )
    (做实验的时候, 本来是应该要做双酶切的, 但是, 据说双酶切的话就会有一个很坑的问题: 太少了, 原来的东西浓度太少了, 那么就做不了了, 或者说做起来很难. )
  • 水 无核酸酶水, 用来将溶液的总体积补全为30μL

水浴酶切

通过37℃水浴加热 1h, (时间超级久, 等待超级无聊. ). 让酶有效地参与反应.

电泳

配胶

这次看了配胶, 总而言之, 感觉不是很难.

  1. 称重, 注意成的时候滤纸是放在分析天平的上面的; 并且称重的时候只能加料, 不能因为加多了然后再舀回去. (所以读数接近了的时候, 可以用右手握住药匙, 然后左手轻轻敲击, 将物质敲落. )
  2. 兑水 (量筒怎么用我还是知道的)
  3. 加热溶解
    (因为不加热的话, 溶液类似于一个悬浊液的状态. 加热溶解了之后, 溶液就是一个澄清的状态. )
    (用的是微波炉, 唯一的要点就是在加热过程中, 在快要沸腾的时候就将火关掉. 令人吃惊的是微波炉竟然可以在中间工作的时候就可以暴力打开!! 算了, 不规范的事情已经不少了. )
  4. 加入染料 嗯, 就是核酸染料, 需要带上塑料手套
  5. 混匀, 准备下一步

倒胶

就是把琼脂凝胶倒到模具里面等它凝固.

上样品

在上样品之前, 首先要在样品上加一些染料. 就是在之前的30μL的梅切体系中加入6μL的染料, 为了使染料和样本混匀, 就需要”吹打”, 也就是用移液枪将染料和样品吸进又吐出移液枪的枪头, 注意不要变成打泡机. (笑)

然后就要把染过色的玩意全部(36μL)放到电涌槽里面去. 这个步骤就要注意不要把琼脂戳破了. 但是实际上我觉得操作还好. (唯一的问题就是, 相较于前一组, 我的量少颜色淡, 颜色淡我也许可以理解, 因为在构建酶切体系的时候, 我的总量应该是超了一点, 然后在加染料的时候, 染料稍微少了点… 诶? 该不会这就是我结果离谱的原因? 不规范操作啊. )

跑电泳

跑电泳

(跑电泳的时候, 里面的水不是水, 因为纯水不导电. )

胶回收

因为跑完电泳之后, 不同的DNA就可以分开了. 但是这还只是在凝胶里面而已, 然后的就是要把这个被放在胶里面的DNA给拿出来.

切条带

在紫外光照射下, 可以看到条带, 然后就用手术刀把条带给切下来, 选择的是后面的线性部分的条带.

(不过也有条带没有分开的, 条带分开成了一团”云雾”的组. )

(不过切的时候太难了, 一刀下去就穿了, 很难控制? 因为我的就被边上的同学切了一块. )

溶解

向胶块中放入等倍体积的溶胶液, 一个正确的换算方式就是: 胶的质量(g) * 1000 μL/g (这里的等倍体积真的是坑, 因为一开始算错了, 变成了*100μL/g, 结果完全没有溶解. ) 然后就50℃水浴放置, 期间不断翻转. (可以将胶块破碎来加速溶解)

吸附 (喜闻乐见的高盐低PH吸附, 低盐高PH释放)

柱平衡

500μL 平衡液加入吸附柱, 离心 12000rpm, 1min

胶溶液吸附

把胶溶液丢到吸附柱里, (建议冷却到室温再上柱, 因为吸附柱在室温结合能力强).

室温放置2 min.

(这里我就要反思了, 因为我觉得当时我应该是没有做到很严谨的步骤, 因为冷却时间不够, 并且放置和接触时间不够久. 所以可能最后的提取浓度不够. )

然后离心 12000rpm, 30-60sec(时间看量的多少决定)

漂洗

600μL 漂洗液, 离心, 重复两次. 然后再空管离心 2min, 最后室温晾干.

洗脱

加入洗脱缓冲液适量, 然后室温放置2min, 离心2min.

(洗脱缓冲液太多会太稀, 但是我觉得太少的话也没用, 虽然这只是一个猜想. 艹, 仔细一看说明书, 洗脱缓冲液体机不应该小于 30μL, 否则就会影响回收效率, 也就是说, 没法达到一个很好的低盐高PH的释放环境, 也就没法达到一个很好的回收效果. )

(哦, 突然发现这里室温放置2min的步骤我好像也没做到位? )

(天哪, 我在干什么? 下次一定要注意这样的 室温放置 的问题. )

浓度检测

我该说低得离谱吗? 测出了0.4(正常的应该是20几的. )

反思

仔细观察了一下实验步骤, 感觉自己当时太慌了, 不过第一次一个人做实验也没办法. (但是这个也不能怪这个, 就像不能把实验失败怪到酶的头上. )

下次记得注意 室温放置 的字样.

并且还要学会读电泳结果.

嗯, 就这样吧.