自曝

惭愧, 这次(主要)的实验我完全没有什么真实感, (因为中间等待的时间实在是太长了… )

所以这次就是把里面主要的参与的部分记录一下, (虽然我知道这些都是最简单的生物实验操作就是了), 也许以后还会有类似的实验或者别的什么吧.

感受态细胞

感受态细胞(competent cell): 理化方法诱导细胞, 吸收周围环境中的DNA分子, 使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态. 主要原理就是通过处理使细胞的通透性变大, 直观的说, 使得细胞膜表面出现一些孔洞, 便于外源基因或载体进入感受态细胞. 由于细胞膜的流动性, 这种孔洞会被细胞自身所修复.

摘自百度百科.

上次的酶切完了的产物经过胶回收(黑历史啊)后, 我们可以得到一坨稀烂的质粒DNA(哦, 用词不当, 这玩意稀得很), 但是为了让它还算是个东西, 就要让它们重新拼回去, 但是显然不是人手动操作, 于是就要用到感受态细胞.

感受态细胞有一个特点就是可以接受外界的DNA, 然后把进来的DNA修复当成自己的.

但是感受态细胞有个问题, 就是非常脆弱. 所以要低温保存. (正常情况下是保存在-70摄氏度下, 要用的时候用冰盒解冻. )

最后还有一个点: 外面的DNA是怎么进去的? 答案是先想办法把这个细胞膜搞得稀疏一点, 就是把这个东西撑大些, 所以就用低渗透的环境, 让外界向细胞渗透: 实验中的做法就是冷水浴.

然后经过超级长久的等待之后, 就去进行震荡培养.

振荡能使培养基与氧气充分接触, 提高溶解氧的供应量, 经振荡培养的菌体繁殖均一, 培养效率高, 广泛应用于菌种筛选和微生物扩大培养, 是微生物生理, 生化, 发酵和其他生命科学研究领域中常用的培养方式.

摘自百度百科

震荡培养

制平板

主要的是超净台的使用, 如何倒胶, 如何涂布.

超净台的使用

没什么流程的感觉, 就简陋地记录一下零星的要点吧.

(照片忘了)

  • 超净台使用前和使用后要用紫外线照射30min (对不起了, 又是一次没怎么注意的操作)
  • 超净台也不是那种全身防护服的东西啦, 没那么可怕
  • 超净台是一个正压环境 (防止外界空气中的细菌进去)
  • 超净台有一个玻璃窗, 可以抬高一点点, 把手放进去操作, 但是这样就会导致手的操作比较拘束, 操作的时候要注意
  • 进入超净台里面要先用酒精消毒手(套)
  • 在超净台里面点一盏酒精灯 一般就是在酒精灯附近操作, 或是用酒精灯消毒
  • 不应该把东西从超净台中拿出又放回 (这就像是把你嘴里的棒棒糖拿出来泡泡洗脚水再…)

如何倒胶

LB培养基(Lysogeny broth, LB), 是微生物學實驗中最常用的營養性培養基, 用於培養大腸桿菌等細菌, 分為液態培养基和加入瓊脂製成的固態培養基. 加入抗生素的 LB 培養基可用於篩選以大腸杆菌爲宿主的選殖.

摘自维基百科

首先有一罐子的经过高温灭菌(灭菌锅)的培养基的溶液(就是上面说的), 这个时候它还很热乎(90多摄氏度), 基本的想法就是把这罐液体分出来一部分, 加入抗生素, 接下来倒入培养皿中, 等待凝固成固体. (我们用的是固体培养基. )

但是这里就要注意, 要先冷却一下再加入抗生素, 为了防止温度过高使其失去活性.

(抗生素加入的量: 1mL溶液1μL抗生素)

然后就到了丢脸环节了.

到的时候要均匀一点, 最好像是有一张手把液体抹平一样, 不要让液体出现像是钳形包围的样子, 否则就有局部凝固导致中间有一块”疤痕”. (还是说倒的速度快一点更好吗. )

如何涂布

拿出上面做好的感受态细胞, (虽然上面忘了说了, 但是我们还做了一组阳性对照组) 想法就是让这些细胞在这个培养基上快乐生长.

感受态细胞的处理

  • 把感受态细胞培养了的溶液离心 (因为我们要的就只是细胞本身)
  • 吸除上清液 (嗯, 这次我吸除的很干净. )
  • 加入LB(液态)适量
  • 用移液枪吹打使细胞重悬
  • 最后把得到的溶液滴到培养皿上

(这里之所以会说是”适量”, 是为了之后的涂布方便, 假如加太多的话, 就会因为干不掉导致涂布太累人. )

涂布棒的使用

我们用的是玻璃涂布棒.

(相较于塑料涂布棒的好处就是把培养基戳破的风险较小. )

  1. 将涂布棒的头浸入酒精中消毒
  2. (在空中晾干一下)放到酒精灯火焰上灼烧
  3. 冷却(防止烫死细胞)后就跟刷墙一样, 让溶液在培养基上的各个角落都均匀分布
  4. 直到表面”干燥”没有液体为止.

培养皿的使用

  • 培养基是倒在小直径的”底”里面的
    (关于什么是底, 真的就是难以定夺)
  • 在倒胶后等待凝固的时候, 盖子要倾斜着靠在皿底上, 不可以直接盖上, 因为这样的冷凝水会滴上去污染
  • 实际培养过程中, 皿是倒置的(皿底在上), 原因还是冷凝水的污染
  • 因为倒置使用的原因, 所以标记还是在皿底上写着好

PCR

因为没什么实际感觉, 所以只好放上图片.

(希望不要被大佬骂)

PCR

电泳

虽然之前讲过了, 但是这一次基本上就是我自己在操作, 血赚. 所以怎么说呢, 可以说收获比较大吧.

配胶

  • 配溶液: 一个电泳槽需要消耗30mL的*1 TBE对0.3g琼脂糖, (注意是琼脂糖, 不是琼脂). (这个时候应该是个很浑浊的溶液)
  • 然后在微波炉中加热至接近沸腾就将微波炉关掉, 反复几次就应该可以得到清澈的溶液.
  • 这个时候加入核酸染料, 混匀.
  • 然后在槽中放上一个”底”和”梳子”, (我也不知道叫什么), 最后倒上溶液, 最后冷却得到胶
  • 转移到电泳槽中, 加*1 TBE至漫过, 然后点样

点样

  • 注意不要把胶戳破
    • 为了这样, 枪管不要倾斜着伸入槽里面, 因为我这样戳穿了侧壁
    • 为了不要把底戳穿, 剩下去的时候就要注意
  • 也不要把胶滴到上面(就是没有滴进槽中)
    • 为了确保枪头在槽里, 可以干一个小操作: 将枪头伸入的时候, 可以轻轻摇一摇, 如果胶会动的话, 就是说明在里面了
  • 点的时候要选择一个合适的marker标记, 就是一个很好的刻度尺, 选择的标准就是要保证在要测量的位置marker 的条带分得比较开就好

跑电泳

点了样以后就通电, 关键是要开快关和启动.

(因为我智障忘了开了)

电泳正常工作的话, 会有气泡产生在电极上.

反正注意不要跑太久, 大概2/3就好, 否则有可能会把胶跑干.

紫外线观察台

观察台

(哦, 拿胶的时候注意带塑料手套)

结果

结果

(结果掉了好多条带, 图一乐吧, 反正就只是练手… )

后记

哇, 没想到还真能写这么多. 果然, 反思之后发现头绪清楚一点了, 但是原理还是没有很透彻, 没法自己设计实验.

以后吧.

某同学: 这些大肠杆菌真是顽强, 经历了这么多残酷的环境, 竟然还能活着.